多肽磷酸化標(biāo)記技術(shù)
磷酸化影響著細(xì)胞生命的方方面面。在細(xì)胞中，大概有1/3的的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是通過(guò)磷酸化修飾的。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，如DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等。磷酸化蛋白質(zhì)及多肽的研究可以幫助人們闡述上述過(guò)程的機(jī)理，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)的本質(zhì)。肽谷生物依據(jù)自身原料優(yōu)勢(shì)和技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可以合成含有磷酸化絲氨酸(pSer)、磷酸化蘇氨酸(pThr)、磷酸化酪氨酸(pTyr)的多肽，并可以提供含有一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，五個(gè)磷酸化位點(diǎn)修飾的高質(zhì)量多肽。
磷酸化多肽主要指肽鏈中的Ser、Tyr和Thr殘基的側(cè)鏈羥基被修飾成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程的必不可少的工具，因此研究蛋白質(zhì)及多肽的磷酸化反應(yīng)并確定成熟簡(jiǎn)便的合成路線就變得非常重要。目前，多肽的磷酸化修飾方法主要有兩種：
（1）將適當(dāng)保護(hù)的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；
（2）多肽序列在樹(shù)脂上合成完后，再對(duì)其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進(jìn)行磷酸化。
即事先將需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并適當(dāng)保護(hù)，然后按照正常SPPS合成流程將磷酸化單體縮合到多肽指定位點(diǎn)。這種方法操作簡(jiǎn)便，已經(jīng)成為多肽單位點(diǎn)磷酸化修飾的主要方法。
采用將磷酸化單體縮合到多肽中的方法進(jìn)行磷酸化修飾時(shí)，磷酸化的氨基酸由于側(cè)鏈修飾的較大基團(tuán)產(chǎn)生的位阻而導(dǎo)致難以與肽鏈縮合，并且之后的氨基酸引入都會(huì)比較困難，尤其在含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)修飾時(shí)，合成將變得異常困難，并且最終產(chǎn)物成分復(fù)雜，難以分離，產(chǎn)率極低。因此，當(dāng)肽鏈中多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化時(shí)，可以考慮采用將多肽序列在樹(shù)脂上合成完后，再對(duì)其中的Ser、Tyr或Thr的側(cè)鏈羥基進(jìn)行磷酸化：其合成過(guò)程主要就是在多肽合成結(jié)束之后，選擇性的脫去要標(biāo)記氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，對(duì)于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)。側(cè)鏈保護(hù)基在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫除。采用這種方法時(shí)，可以采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，然后在過(guò)氧酸條件下氧化生成磷?；?，完成反應(yīng)。
激酶活性檢測(cè)
在體外，激酶活性的檢測(cè)是將經(jīng)免疫沉淀法獲得的蛋白激酶與某一底物在ATP環(huán)境下共同孵育，然后再檢測(cè)。磷酸化底物的測(cè)量可以通過(guò)報(bào)告系統(tǒng)如比色法、放射性或熒光檢測(cè)而得。
磷酸化特定性抗體的開(kāi)發(fā)
磷酸化抗體已被許多研究者使用。首先合成磷酸化多肽，即圍繞靶蛋白磷酸化位點(diǎn)的氨基酸序列，接著共軛偶聯(lián)至血藍(lán)蛋白(KLH)上進(jìn)行免疫。免疫血清將流經(jīng)多肽親和層析柱， 從而得到一個(gè)非常特異的免疫制劑。檢測(cè)的成功與否取決于抗體對(duì)靶磷酸化蛋白的特異性和親和力。
免疫印跡（Western Blot）
許多磷酸化抗體是十分敏感的，可以很容易地檢測(cè)到常規(guī)樣品中的磷酸化蛋白。化學(xué)發(fā)光和比色法都是較常見(jiàn)的檢測(cè)方法，蛋白Markers通常用來(lái)為蛋白質(zhì)量提供標(biāo)準(zhǔn)。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)
ELISAs提供一種間接測(cè)量激酶活性的方法，其比WB更容易定量。磷酸化特異的ELISA技術(shù)可以很輕易地通過(guò)使用一個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)量化結(jié)果。通過(guò)雙抗體夾心方法，應(yīng)用兩個(gè)靶蛋白的特異性抗體可使檢測(cè)呈現(xiàn)高特異性。此外,基于微孔板的ELISAs檢測(cè)，更是具有高通量、 微量和對(duì)低豐度蛋白檢測(cè)的特點(diǎn)。
細(xì)胞ELISA（Cell-Based ELISA）
通過(guò)分析完整的細(xì)胞中磷酸化蛋白，可更準(zhǔn)確地反應(yīng)特性的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。一般磷酸化抗體多通過(guò)熒光或比色法來(lái)檢測(cè)磷酸化狀態(tài)。
流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和ICC/IHC
流式細(xì)胞術(shù)因其快速、定量、單細(xì)胞分析等特點(diǎn)而非常具有優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞被誘導(dǎo)后，通過(guò)甲醛或多聚甲醛將其與磷酸化蛋白交聯(lián)固定，然后分析。固定的細(xì)胞需經(jīng)通透處理，以便磷酸化抗體的進(jìn)入。
質(zhì)譜分析（Mass Spectrometry）
質(zhì)譜(MS)技術(shù)是一項(xiàng)用于識(shí)別磷酸化蛋白、磷酸化多肽和磷酸化殘基序列的便利工具。利 用MS卓越的靈敏度和分辨率，可識(shí)別某一單個(gè)蛋白質(zhì)或多肽。但來(lái)自磷酸化多肽的信號(hào)通常較弱，因而新的技術(shù)正在被研發(fā)以增強(qiáng)MS信號(hào)。這些策略包括固化金屬親和層析，磷酸化抗體的豐富，化學(xué)修飾方法和用生物素部份置換磷酸基團(tuán)。
xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技術(shù)
Multi-Analyte profiling技術(shù)涉及磷酸化抗體的應(yīng)用和基于微孔板及膜的檢測(cè)方式。這些檢測(cè)技術(shù)可提供大量的數(shù)據(jù)，卻只需極少量的樣本。然而，這些檢測(cè)技術(shù)并不比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法敏感，原因在于潛在的抗體交叉反應(yīng)。
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