FITC&AMC等熒光標(biāo)記技術(shù)
熒光標(biāo)記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，受到紫外光或藍(lán)紫光照射時(shí)，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光。熒光標(biāo)記技術(shù)指利用熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來提供被研究對(duì)象的信息。熒光標(biāo)記的無放射物污染，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，使得熒光標(biāo)記物在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。人們利用利用熒光標(biāo)記的多肽來檢測目標(biāo)蛋白的活性，并將其發(fā)展的高通量活性篩選方法應(yīng)用于疾病治療靶點(diǎn)蛋白的藥物篩選和藥物開發(fā)（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。肽谷生物經(jīng)過長期開發(fā)，能夠提供技術(shù)成熟的各種熒光標(biāo)記多肽。
除了FRET熒光淬滅組合，肽谷生物還可以提供包括FITC, FAM, TAMRA, Biotin等種類齊全的多肽熒光標(biāo)記服務(wù)。
下面是一些常見的多肽修飾熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)：
下表是一些熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長Ex(nm)和發(fā)射光波長Em(nm):
羥基香豆素
325
386
R-phycoerythrin
(PE) (489)
565
578
丹磺酰氯
340
578
Rhodamine Red-X
560
580
AMC
345
445
Tamara
565
578
甲氧基香豆素
360
410
Alexa fluor 555
556
573
Alexa fluor 系列
345
442
Alexa fluor 546
556
573
氨基香豆素
350
445
Rox
575
602
Dabcyl
453
-
Alexa fluor 568
578
603
Cy2
490
510
Texas Red
589
615
FAM
495
517
Alexa fluor 594
590
617
Alexa fluor 488
494
517
Alexa fluor
621
639
FITC
495
519
Alexa fluor 633
650
668
Alexa fluor 430
430
545
Cy5 (625)
650
670
5-FAM
492
518
Alexa fluor 660
663
690
Alexa fluor 532
530
555
Cy5.5
675
694
HEX
535
556
TruRed 490
675
695
5-TAMRA
542
568
Alexa fluor 680
679
702
Cy3
550
570
Cy7
743
767
TRITC
547
572
Cy3.5
581
596
FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過兩種方式將FITC標(biāo)記于多肽上：(1) 將FITC標(biāo)記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護(hù)的鳥氨酸（ornithine）側(cè)鏈氨基上；(2) 將FITC標(biāo)記于多肽N端氨基。
當(dāng)在N端標(biāo)記時(shí)，建議在最后一個(gè)氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入烷基間隔器（alkyl spacer）如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來形成熒光素，通常會(huì)伴有最后一個(gè)氨基酸的去除，但當(dāng)有一個(gè)間隔器如氨基己酸，或者是通過非酸性環(huán)境將目的肽從樹脂上切下來時(shí)，這種情況可避免。空間位阻被認(rèn)為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。
Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標(biāo)記的多肽上。
AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)是一種應(yīng)用廣泛的熒光標(biāo)記試劑， 與其他熒光染料不同的是，AMC修飾多肽分子是從C端進(jìn)行：
（1）AMC與肽鏈C端第一個(gè)氨基酸反應(yīng);
（2）固相合成整條肽鏈（從第二個(gè)氨基酸開始），并且保留整條肽鏈的側(cè)鏈保護(hù)基和最后一個(gè)氨基保護(hù)基；
（3）液相縮合AA-AMC與全保護(hù)的肽鏈；
（4）切除保護(hù)基，完成肽鏈的修飾。
通常，生物素、FITC等染料可任意標(biāo)記在多肽N端或C端。但我們推薦N端標(biāo)記，其成功率更高、所需時(shí)間更短、更易操作。由于多肽都是從C端往N端合成，所以N端修飾將是固相合成的最后一步，不再需要額外的偶聯(lián)步驟。相反，如果是C端標(biāo)記，則需要附加步驟，而過程會(huì)更復(fù)雜。
大多數(shù)染料都是大型的芳香分子，如此龐大分子的介入有助于避免標(biāo)簽和多肽之間的相互作用。這將有助于保持多肽的構(gòu)象和生物學(xué)活性。一般來說，推薦引入一個(gè)柔性間隔如Ahx(一個(gè)6碳化合物)會(huì)使熒光標(biāo)記更加穩(wěn)定。否則FITC將很容易與其他任何位置的半胱氨酸的巰基或賴氨酸的氨基發(fā)生連接。
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